摘要：瘢痕疙瘩作為一種異常增生性瘢痕，不僅嚴重影響患者外觀，還常伴隨瘙癢、疼痛等不適癥狀，且治療后易復發(fā)，是整形外科與皮膚科領域亟待攻克的難題。本研究聚焦于 Fas 基因轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細胞誘導凋亡這一創(chuàng)新性策略，旨在探尋瘢痕疙瘩的有效治療途徑。通過一系列嚴謹?shù)膶嶒灢僮?，成功?Fas 基因轉(zhuǎn)染至瘢痕疙瘩成纖維細胞，借助多種先進檢測手段，證實轉(zhuǎn)染后細胞凋亡顯著增加，深入剖析了其內(nèi)在分子機制，為臨床治療瘢痕疙瘩提供了潛力的理論基礎與全新思路，有望改善現(xiàn)有治療格局，提升瘢痕疙瘩患者生活質(zhì)量。
瘢痕疙瘩是皮膚損傷后，以成纖維細胞過度增殖、細胞外基質(zhì)大量沉積為主要特征的病理性瘢痕。與普通瘢痕不同，瘢痕疙瘩超出原始損傷范圍持續(xù)生長，無自發(fā)消退趨勢，給患者身心帶來沉重負擔。當前臨床治療手段多樣，涵蓋手術切除、激光治療、糖皮質(zhì)激素注射等，但復發(fā)率居高不下，療效難以令人滿意。
細胞凋亡作為機體維持細胞數(shù)量穩(wěn)態(tài)的關鍵程序性死亡方式，在瘢痕疙瘩發(fā)病及治療中的作用備受矚目。Fas 基因，又稱 CD95 或 Apo - 1，隸屬腫瘤壞死因子受體超家族，其編碼的跨膜蛋白與 Fas 配體（FasL）結(jié)合后，能夠激活一系列細胞內(nèi)凋亡信號通路，誘導細胞凋亡。既往研究表明，瘢痕疙瘩成纖維細胞存在凋亡抵抗現(xiàn)象，凋亡相關基因及通路功能失調(diào)。基于此，本研究創(chuàng)新性地提出利用 Fas 基因轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細胞，人為啟動凋亡程序，糾正其異常增殖狀態(tài)，為瘢痕疙瘩治療開辟新路徑。
瘢痕疙瘩組織標本取自臨床手術切除患者，經(jīng)倫理委員會批準及患者知情同意。原代瘢痕疙瘩成纖維細胞采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)，使用含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培養(yǎng)基，置于 37°C、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合至 80% - 90% 進行傳代。
Fas 基因表達質(zhì)粒由本實驗室構建，含綠色熒光蛋白（GFP）報告基因，便于后續(xù)轉(zhuǎn)染效果觀察；轉(zhuǎn)染試劑選用脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000，其轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性低；Annexin V - FITC/PI 凋亡檢測試劑盒用于檢測細胞凋亡；蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）所需一抗包括抗 - Fas、抗 - caspase - 3、抗 - Bcl - 2 等，二抗為 HRP 標記的相應 IgG；實時定量 PCR 所用引物依據(jù) Fas 基因及內(nèi)參基因 β - actin 序列設計合成，由專業(yè)生物公司定制。
將處于對數(shù)生長期的瘢痕疙瘩成纖維細胞以 2 × 10?個 / 孔接種于 6 孔板，待細胞貼壁后，更換無血清 DMEM 培養(yǎng)基。按照 Lipofectamine 2000 說明書，分別將適量質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑輕柔混合，室溫孵育 20 分鐘后逐滴加入各孔，輕輕搖勻，設空白對照組（未轉(zhuǎn)染細胞）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒細胞）與實驗組（轉(zhuǎn)染 Fas 基因質(zhì)粒細胞），每組設 3 個復孔。轉(zhuǎn)染 4 - 6 小時后，更換為含血清的完整培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 小時后于熒光顯微鏡下觀察 GFP 表達，評估轉(zhuǎn)染效率。
流式細胞術：轉(zhuǎn)染 48 小時后，收集各組細胞，用預冷 PBS 洗滌 2 次，按 Annexin V - FITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書操作，先加入 Annexin V - FITC 避光孵育 15 分鐘，再加入 PI 孵育 5 分鐘，隨即上機檢測，通過流式細胞儀分析凋亡細胞比例，Annexin V?/PI?為早期凋亡細胞，Annexin V?/PI?為晚期凋亡細胞。
Western Blot：收集細胞，加入 RIPA 裂解液提取總蛋白，經(jīng) BCA 法測定蛋白濃度后，等量蛋白上樣進行 SDS - PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉 1 小時，分別加入抗 - Fas、抗 - caspase - 3、抗 - Bcl - 2 等一抗，4°C 孵育過夜，TBST 洗膜后加入二抗室溫孵育 1 小時，最后用 ECL 化學發(fā)光試劑顯影，以 β - actin 為內(nèi)參，分析目的蛋白表達水平變化，探究凋亡相關蛋白調(diào)控機制。
提取各組細胞總 RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA，以 cDNA 為模板，加入特異性引物及 SYBR Green 熒光染料進行實時定量 PCR 反應。反應條件為：95°C 預變性 10 分鐘，95°C 變性 15 秒，60°C 退火延伸 1 分鐘，共 40 個循環(huán)，通過 2?ΔΔCT 法計算 Fas 基因相對表達量，從基因轉(zhuǎn)錄水平明確轉(zhuǎn)染效果及對細胞凋亡的影響。
采用 CCK - 8 法檢測細胞增殖能力。轉(zhuǎn)染后不同時間點（0、24、48、72 小時），每孔加入 10 μL CCK - 8 試劑，37°C 孵育 2 小時，用酶標儀測定 450 nm 處吸光度值，以時間為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制細胞生長曲線，直觀反映 Fas 基因轉(zhuǎn)染對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖活性的抑制作用。
熒光顯微鏡下可見，實驗組大量細胞呈現(xiàn)明亮綠色熒光，表明 Fas 基因質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入瘢痕疙瘩成纖維細胞，經(jīng)計數(shù)統(tǒng)計，轉(zhuǎn)染效率達 60% - 70%，滿足后續(xù)實驗要求；空白對照組與陰性對照組無明顯熒光信號，排除非特異性熒光干擾，證實轉(zhuǎn)染操作精準性與質(zhì)粒特異性。
流式細胞術：與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組早期及晚期凋亡細胞比例顯著升高，凋亡率分別從對照組的（5.2 ± 1.3）%、（3.8 ± 0.9）% 提升至實驗組的（23.5 ± 3.2）%、（18.7 ± 2.6）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P < 0.01），有力證明 Fas 基因轉(zhuǎn)染可有效誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡。
Western Blot：Western Blot 結(jié)果顯示，實驗組細胞內(nèi) Fas 蛋白表達顯著上調(diào)，caspase - 3 蛋白裂解活化增強，呈現(xiàn)出明顯的活性片段，而抗凋亡蛋白 Bcl - 2 表達水平下降。這一系列變化契合細胞內(nèi)經(jīng)典凋亡通路激活特征，F(xiàn)as 蛋白作為上游信號分子啟動凋亡程序，激活下游 caspase 級聯(lián)反應，同時抑制抗凋亡因子 Bcl - 2，協(xié)同促進細胞凋亡進程。
實時定量 PCR 結(jié)果表明，實驗組 Fas 基因相對表達量較空白對照組與陰性對照組大幅提高，約為對照組的 8 - 10 倍，精準從基因轉(zhuǎn)錄層面證實轉(zhuǎn)染的 Fas 基因高效表達，為后續(xù)蛋白合成及凋亡誘導提供充足 “原料"，凸顯基因轉(zhuǎn)染策略在分子水平的有效性。
CCK - 8 檢測所得細胞生長曲線直觀呈現(xiàn)出實驗組細胞增殖明顯受抑，隨時間延長，吸光度值增長緩慢，與對照組快速上升的增殖趨勢形成鮮明對比。尤其在轉(zhuǎn)染 48 小時后，實驗組細胞增殖抑制率達 40% - 50%，進一步印證 Fas 基因轉(zhuǎn)染不僅誘導細胞凋亡，還對瘢痕疙瘩成纖維細胞異常增殖能力予以有效遏制，直擊瘢痕疙瘩發(fā)病核心 —— 細胞過度增殖問題。
本研究開創(chuàng)性地將 Fas 基因轉(zhuǎn)染技術應用于瘢痕疙瘩成纖維細胞，通過全方面、多層次實驗驗證，確鑿證實該策略能高效誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖，為瘢痕疙瘩治療提供新穎靶點與可行方案。從分子機制解析，F(xiàn)as 基因轉(zhuǎn)染后上調(diào)的 Fas 蛋白與內(nèi)源性或外源性 FasL 結(jié)合，匯聚死亡誘導信號復合物（DISC），激活起始 caspase - 8，進而切割執(zhí)行 caspase - 3，啟動細胞凋亡級聯(lián)反應；同時，Bcl - 2 表達下調(diào)削弱細胞抗凋亡能力，“一推一拉" 雙向助力細胞走向凋亡歸宿。
相較于傳統(tǒng)治療手段，F(xiàn)as 基因轉(zhuǎn)染療法優(yōu)勢顯著。手術切除創(chuàng)傷大、復發(fā)風險高；糖皮質(zhì)激素注射易引發(fā)局部皮膚、色素沉著等不良反應；激光治療作用深度有限，難以深層瘢痕疙瘩組織。而基因療法直擊瘢痕疙瘩發(fā)病根源 —— 細胞異常生物學行為，精準調(diào)控細胞命運，且理論上具有長效性，一次成功轉(zhuǎn)染可持續(xù)影響細胞功能，降低復發(fā)可能。
不過，本研究成果邁向臨床應用仍面臨諸多挑戰(zhàn)?；蜣D(zhuǎn)染載體安全性與有效性平衡難題，盡管脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑本次表現(xiàn)出良好轉(zhuǎn)染效率，但長期體內(nèi)滯留、潛在免疫原性不容忽視；再者，如何精準把控轉(zhuǎn)染基因劑量與作用時間，避免過度凋亡引發(fā)正常組織損傷，亟待深入探索劑量 - 效應關系；此外，體內(nèi)復雜微環(huán)境對轉(zhuǎn)染細胞存活、功能維持影響未知，構建契合瘢痕疙瘩病理特征的動物模型，開展體內(nèi)預實驗迫在眉睫。
本研究成功實現(xiàn) Fas 基因轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細胞，全方面驗證其誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖效能，初步揭示內(nèi)在分子機制，為瘢痕疙瘩基因治療奠定堅實理論基礎。雖距離臨床轉(zhuǎn)化尚有漫漫長路，但點亮了瘢痕疙瘩精準、靶向治療希望之光，后續(xù)將圍繞載體優(yōu)化、劑量調(diào)控、體內(nèi)驗證持續(xù)深耕，致力于突破技術瓶頸，早日讓瘢痕疙瘩患者受益于基因治療革新成果，重塑健康肌膚與自信人生。展望未來，伴隨基因編輯、納米技術等多領域交叉融合，瘢痕疙瘩治療有望迎來性變革，本研究成果也將成為這場變革征程的關鍵基石，助力攻克瘢痕疙瘩這一醫(yī)學頑疾。
在研究全程，團隊秉持嚴謹科學態(tài)度，從實驗設計、操作執(zhí)行到數(shù)據(jù)分析，均嚴格遵循國際前沿科研規(guī)范，力保實驗結(jié)果真實可靠、結(jié)論經(jīng)得起檢驗。未來研究方向已明晰，我們熱忱歡迎國內(nèi)外同行攜手共進，于瘢痕疙瘩基因治療領域深度挖掘，共攀醫(yī)學科研高峰，為全球瘢痕疙瘩患者謀福祉。
