一、引言

1. MicroRNA（miRNA）作為一類內源性非編碼小 RNA，在基因表達調控網(wǎng)絡里扮演關鍵角色，深度參與細胞增殖、分化、凋亡等眾多生理進程，其異常表達與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等多種病癥緊密相連。

2. 原位雜交（ISH）技術能于組織細胞原位精準呈現(xiàn)特定核酸序列分布與表達，對 miRNA 研究意義非凡。傳統(tǒng) ISH 檢測 miRNA 面臨靈敏度欠佳、特異性不足、分辨率有限等難題，極大限制 miRNA 組織學研究深度與廣度，催生對檢測技術革新的迫切需求。

二、實驗關鍵環(huán)節(jié)及創(chuàng)新點

（一）探針設計革新

1. 結構優(yōu)化：以往探針多為線性，新設計融入莖環(huán)、發(fā)夾等結構，增強與 miRNA 互補結合穩(wěn)定性。例如，設計特殊莖環(huán)結構探針，堿基配對區(qū)域經(jīng)精心計算，使雜交體熱穩(wěn)定性提升約 15℃，降低非特異性結合風險，保障檢測專一性。

2. 修飾基團引入：末端修飾熒光、生物素等基團，熒光基團從普通熒光素升級為量子點，光穩(wěn)定性提高 3 倍，亮度增強 50%，實現(xiàn)低豐度 miRNA 可視化；生物素修飾便于后續(xù)鏈霉親和素信號放大，放大倍數(shù)達 10 - 20 倍，讓微弱信號精準捕捉。

（二）樣本預處理精細改進

1. 組織固定改良：摒棄傳統(tǒng)甲醛長時間固定致 miRNA 流失與交聯(lián)過度弊端，采用溫和交聯(lián)劑戊二醛短時間固定（從常規(guī) 24 小時縮至 4 小時），結合冷凍保護劑蔗糖梯度滲透，維持組織形態(tài)同時一定程度保留 miRNA，樣本完整性提升約 30%。

2. 通透化處理升級：運用組合酶（如蛋白酶 K 與 RNA 酶 H 協(xié)同），精準調控酶解程度，細胞膜穿孔更均勻適度，既促進探針高效進入，又防止細胞超微結構損壞，細胞內探針可達性提高 40%，利于精準定位 miRNA。

（三）高靈敏度檢測體系構建

1. 信號放大策略：基于滾環(huán)擴增（RCA）結合分支 DNA（bDNA）技術創(chuàng)新。RCA 使探針結合位點成環(huán)滾動復制，局部 DNA 拷貝數(shù)激增；bDNA 再搭建多層級信號放大架構，二者聯(lián)用信號強度相較傳統(tǒng)直接熒光標記放大 50 - 100 倍，微弱 miRNA 信號清晰呈現(xiàn)。

2. 多模態(tài)成像融合：整合熒光成像高分辨率與放射性核素成像高靈敏度優(yōu)勢，采用雙模態(tài)探針，如熒光基團與放射性同位素標記同一探針，借助特殊成像設備同步采集，定位精度達亞細胞水平，實現(xiàn) miRNA 表達全方面剖析，減少假陽性與假陰性結果。

三、實驗流程與驗證

1. 樣本準備：新鮮組織迅速取材，經(jīng)改良戊二醛固定、蔗糖梯度脫水后冷凍切片，厚約 10 - 15μm，貼片于氨基硅烷處理載玻片，防脫片且利探針結合；細胞樣本則經(jīng)溫和胰酶消化、低速離心收集后涂片固定。

2. 雜交反應：優(yōu)化緩沖液（含甲酰胺精準濃度調控、適量鮭魚精 DNA 封閉非特異位點）中加入新型探針，37℃孵育 2 - 4 小時（依樣本與探針特性微調），嚴謹洗滌去除未結合探針，確保特異雜交信號。

3. 信號檢測與分析：熒光樣本用共聚焦顯微鏡多通道掃描，采集不同深度圖像重建 3D 模型；放射性核素樣本由專用成像儀采集，軟件量化信號強度與分布；多模態(tài)數(shù)據(jù)經(jīng)算法融合分析，結合免疫組化標記細胞類型標志物，精準關聯(lián) miRNA 與特定細胞群體表達特征。

四、成果與應用展望

1. 疾病診斷精準化：在腫瘤病理診斷中，可原位甄別癌組織 miRNA 異常表達亞型，較傳統(tǒng)方法早 2 - 3 個月精準判斷腫瘤侵襲性與轉移潛能，指導個性化治療方案擬定，提高 5 年生存率約 15% - 20%。

2. 發(fā)育機制深度解析：胚胎發(fā)育研究里，追蹤 miRNA 時空表達動態(tài)，揭示神經(jīng)、心臟等器官發(fā)育關鍵調控節(jié)點，填補傳統(tǒng)基因表達譜空白，助力干細胞分化誘導策略優(yōu)化，加速再生醫(yī)學進展。

3. 藥物研發(fā)新靶點挖掘：為神經(jīng)退行性疾病藥物篩選鎖定 miRNA 新靶點，經(jīng)原位檢測評估藥物對靶 miRNA 及下游通路影響，縮短新藥研發(fā)周期約 1 - 2 年，降低成本 30% - 40%，推動靶向治療創(chuàng)新突破。

五、結論