摘要：本研究旨在將細(xì)胞電通透技術(shù)應(yīng)用于DNA肌肉轉(zhuǎn)染，通過優(yōu)化電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖時(shí)值和質(zhì)粒劑量等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)高效電轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)采用增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）基因質(zhì)粒作為報(bào)告基因，注射到小鼠脛前肌后給予特定電脈沖，轉(zhuǎn)染率顯著提高。該方法為基因治療及體內(nèi)基因表達(dá)研究提供了新思路和應(yīng)用前景。

引言

綠色熒光蛋白（GFP）是一種來自水母的蛋白質(zhì)，具有更好的熒光性質(zhì)，能夠在特定波長光的激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。近年來，GFP被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究中，特別是在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中得到了廣泛認(rèn)可。利用GFP基因的表達(dá)，科學(xué)家可以追蹤細(xì)胞、組織以及整個(gè)生物體系的運(yùn)動(dòng)和功能。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中，通過將GFP基因轉(zhuǎn)入目標(biāo)細(xì)胞或組織中，科學(xué)家可以用熒光顯微鏡觀察其在生物中的位置和運(yùn)動(dòng)軌跡，繁殖情況以及基因表達(dá)水平等重要信息。

肌肉是非病毒載體基因轉(zhuǎn)染的良好場(chǎng)所，可以長時(shí)間表達(dá)基因產(chǎn)物，且在體內(nèi)容易被觸及。通過骨骼肌轉(zhuǎn)染治療性基因，可用于治療進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良等肌肉本身疾病，還可以用于表達(dá)血管生成因子治療肢體缺血性疾病或合成疫苗等。然而，單純肌肉注射裸基因或者含有報(bào)告基因的質(zhì)粒其表達(dá)水平極低，不易獲得具有顯著性的有效結(jié)果。

1998年，Mir等提出了肌肉基因電轉(zhuǎn)染的新方法，通過細(xì)胞電通透作用，可以簡單而又有效地將非病毒載體基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物肌肉，包括靈長類動(dòng)物。肌肉基因電轉(zhuǎn)染成為研究的熱門領(lǐng)域，并有望將來被用于腫瘤、貧血等疾病的臨床治療。本研究旨在探討肌肉基因電轉(zhuǎn)染的條件，為后續(xù)利用肌肉進(jìn)行抗腫瘤基因的電轉(zhuǎn)染研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1.1 質(zhì)粒

pEGFP-C1綠色熒光蛋白質(zhì)粒，由吉林大學(xué)前列腺疾病防治研究中心惠贈(zèng)（以下稱為EGFP質(zhì)粒）。EGFP質(zhì)粒置于大腸E.coli菌JM109內(nèi)擴(kuò)增，堿裂解法提取、純化。瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒，其中超螺旋結(jié)構(gòu)占70%～80%，無RNA殘留。質(zhì)粒溶解于K-PBS溶液（NaCl 30.8 mmol·L?1、KCl 20.7 mmol·L?1、Na?HPO? 8.1 mmol·L?1、KH?PO? 1.46 mmol·L?1、MgCl? 10 mmol·L?1溶解于雙蒸水）中，定量，調(diào)節(jié)質(zhì)粒濃度為1 g·L?1。

1.2 動(dòng)物

昆明系小白鼠購于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，共160只，4～6周齡，體重18～20 g，雌雄各半，隨機(jī)分組，每組8只。

1.3 電通透儀

電通透儀由方波電脈沖發(fā)生器和針式電極組成（自行研制）。方波電脈沖發(fā)生器輸出電脈沖主要指標(biāo)：電場(chǎng)強(qiáng)度0～2500 V·cm?1，脈沖時(shí)值0～100 ms，脈沖次數(shù)0～15次，脈沖頻率0～10 Hz。針式電極為雙針電極，正負(fù)極間距0～1 cm，為銀制電極。

1.4 肌肉基因電轉(zhuǎn)染參數(shù)的確定

濃度為1 g·L?1質(zhì)粒根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要量注射到小鼠的脛前肌，注射后給予電脈沖，針式電極間距0.6 cm、次數(shù)8次、頻率1 Hz為固定參數(shù)。1周后處死動(dòng)物，取小腿脛前肌冰凍切片后熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4.1 電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖時(shí)值的確定

EGFP質(zhì)粒DNA 15 μg，注入30 s后給予電脈沖。按電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖時(shí)值共分為8組，即20和50 ms組分別給予電場(chǎng)強(qiáng)度0、100、200和400 V·cm?1。觀察不同電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖時(shí)值對(duì)轉(zhuǎn)染率的影響。其中，0 V·cm?1的20和50 ms組相當(dāng)于單純質(zhì)粒肌肉注射實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 注入質(zhì)粒劑量的確定

電場(chǎng)強(qiáng)度200 V·cm?1、脈沖時(shí)值20 ms，注入30 s后給予電脈沖。按質(zhì)粒DNA注入的量分為3組，即7.5、15和30 μg組。

1.4.3 注入質(zhì)粒后給予電脈沖的時(shí)間間隔的確定

質(zhì)粒DNA 15 μg，電場(chǎng)強(qiáng)度200 V·cm?1、脈沖時(shí)值20 ms。按注入后給予電脈沖的時(shí)間間隔分為2組，即注入質(zhì)粒30 s后給予電脈沖（electric pulse, EP）組和注入質(zhì)粒1 h后給予EP組。

1.4.4 轉(zhuǎn)染后DNA表達(dá)最佳時(shí)間的確定

質(zhì)粒DNA 15 μg，電場(chǎng)強(qiáng)度200 V·cm?1、脈沖時(shí)值20 ms，注入30 s后給予電脈沖。按轉(zhuǎn)染后處死動(dòng)物進(jìn)行觀察的時(shí)間不同分為7組，即按處死動(dòng)物的不同時(shí)間分為轉(zhuǎn)染后第1、3、7、14、21、28和35 d組。

1.5 轉(zhuǎn)染陽性肌纖維的確定

所取的骨骼肌標(biāo)本先迅速置于液氮中冰凍，然后保存在-80℃冰箱中。取轉(zhuǎn)染區(qū)骨骼肌做冰凍切片，厚度為100 μm，熒光顯微鏡下觀察到陽性轉(zhuǎn)染的肌纖維發(fā)出綠色熒光。發(fā)現(xiàn)陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，切片厚度改為12 μm，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，與光鏡下對(duì)比后計(jì)數(shù)，按以下公式計(jì)算轉(zhuǎn)染率。

結(jié)果

EGFP質(zhì)粒15 μg注射到小鼠的脛前肌，在注入后給予如下參數(shù)，即電脈沖200 V·cm?1，20 ms，1 Hz，8次，轉(zhuǎn)染率最高，可達(dá)（73.2±7.2）%。EGFP質(zhì)粒注射后不會(huì)在細(xì)胞外立即降解，注射質(zhì)粒DNA 1 h內(nèi)給予電脈沖不影響轉(zhuǎn)染率；15 μg為適當(dāng)?shù)腄NA劑量；EGFP蛋白的表達(dá)，7 d達(dá)到高峰。

討論

2.1 電轉(zhuǎn)染法優(yōu)化參數(shù)的確定

本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)，確定了肌肉基因電轉(zhuǎn)染的最佳參數(shù)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)EGFP質(zhì)粒劑量為15 μg，電場(chǎng)強(qiáng)度為200 V·cm?1，脈沖時(shí)值為20 ms，脈沖頻率為1 Hz，脈沖次數(shù)為8次時(shí)，轉(zhuǎn)染率最高，可達(dá)（73.2±7.2）%。這一結(jié)果為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了重要的參考依據(jù)。

2.2 電轉(zhuǎn)染法提高轉(zhuǎn)染率的機(jī)制

與單純EGFP質(zhì)粒肌肉注射相比，DNA肌肉電轉(zhuǎn)染可極大地提高其轉(zhuǎn)染率。這一結(jié)果可能與細(xì)胞電通透作用有關(guān)。細(xì)胞電通透是一種利用短暫的高壓電脈沖改變細(xì)胞膜通透性的技術(shù)，可使細(xì)胞膜形成微小孔洞，允許外源DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。本研究通過優(yōu)化電脈沖參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了高效、安全的DNA肌肉轉(zhuǎn)染。

2.3 電轉(zhuǎn)染法在基因治療中的應(yīng)用前景

肌肉是非病毒載體基因轉(zhuǎn)染的良好場(chǎng)所，可以長時(shí)間表達(dá)基因產(chǎn)物，且在體內(nèi)容易被觸及。通過骨骼肌轉(zhuǎn)染治療性基因，可用于治療進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良等肌肉本身疾病，還可以用于表達(dá)血管生成因子治療肢體缺血性疾病或合成疫苗等。本研究為肌肉基因電轉(zhuǎn)染提供了優(yōu)化參數(shù)，為基因治療及體內(nèi)基因表達(dá)研究提供了新思路和應(yīng)用前景。

2.4 研究的創(chuàng)新點(diǎn)

本研究創(chuàng)新性地將細(xì)胞電通透技術(shù)應(yīng)用于DNA肌肉轉(zhuǎn)染，并通過優(yōu)化電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖時(shí)值和質(zhì)粒劑量等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了高效電轉(zhuǎn)染。此外，本研究還通過一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了電轉(zhuǎn)染法的安全性和可行性，為基因治療及體內(nèi)基因表達(dá)研究提供了新思路和應(yīng)用前景。

結(jié)論

本研究將細(xì)胞電通透技術(shù)應(yīng)用于DNA肌肉轉(zhuǎn)染，通過優(yōu)化電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖時(shí)值和質(zhì)粒劑量等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了高效電轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)EGFP質(zhì)粒劑量為15 μg，電場(chǎng)強(qiáng)度為200 V·cm?1，脈沖時(shí)值為20 ms，脈沖頻率為1 Hz，脈沖次數(shù)為8次時(shí)，轉(zhuǎn)染率最高，可達(dá)（73.2±7.2）%。與單純EGFP質(zhì)粒肌肉注射相比，DNA肌肉電轉(zhuǎn)染可極大地提高其轉(zhuǎn)染率。本研究為肌肉基因電轉(zhuǎn)染提供了優(yōu)化參數(shù)，為基因治療及體內(nèi)基因表達(dá)研究提供了新思路和應(yīng)用前景。