小鼠背根神經(jīng)節(jié)取材及電穿孔轉染條件優(yōu)化

更新時間：2024-12-20 點擊次數(shù)：191

摘要：本研究聚焦小鼠背根神經(jīng)節(jié)，旨在優(yōu)化其取材與電穿孔轉染條件。通過系統(tǒng)實驗，詳細探討取材流程中的關鍵環(huán)節(jié)與多種電穿孔轉染參數(shù)的影響，為神經(jīng)科學研究提供精準且高效的實驗方法，以提升相關研究的數(shù)據(jù)質量與成果可靠性。

一、引言

小鼠背根神經(jīng)節(jié)在神經(jīng)科學研究中占據(jù)重要地位，其與感覺信息的傳遞和處理密切相關。對其進行基因操作，如電穿孔轉染，有助于深入探究神經(jīng)生理與病理機制。然而，目前的取材及轉染方法仍存在一些局限性，例如取材過程可能導致神經(jīng)節(jié)損傷影響細胞活性，轉染效率不穩(wěn)定等。因此，優(yōu)化小鼠背根神經(jīng)節(jié)取材及電穿孔轉染條件具有重要的科學意義。

二、材料與方法

（一）實驗動物

選用健康的成年 C57BL/6 小鼠，體重 20 - 25g。小鼠飼養(yǎng)于標準動物房，溫度控制在 22 - 24°C，濕度 40% - 60%，自由進食和飲水，且實驗操作遵循動物倫理規(guī)范。

（二）主要試劑與儀器

試劑

含有目的基因的質粒（自行構建并鑒定）。
細胞培養(yǎng)液（DMEM 高糖培養(yǎng)基，添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素）。
麻醉劑。
電穿孔緩沖液（自行配制，含特定濃度的無機鹽和緩沖物質）。

儀器

精密手術器械（顯微鑷、顯微剪等）。
電穿孔儀（具備可調節(jié)電壓、電容和脈沖時間等參數(shù)功能）。
細胞培養(yǎng)箱（可精確控制溫度、CO?濃度和濕度）。

（三）小鼠背根神經(jīng)節(jié)取材

麻醉小鼠

按照 50mg/kg 的劑量腹腔注射麻醉劑，待小鼠進入深度麻醉狀態(tài)（通過觀察小鼠對疼痛刺激無反應，如夾尾無掙扎等）。

消毒與定位

將小鼠背部皮膚用 75% 酒精棉球消毒，然后將小鼠置于解剖臺上，俯臥位固定。依據(jù)小鼠的解剖結構，確定脊柱位置，標記出需要取材的背根神經(jīng)節(jié)節(jié)段（通常為腰段）。

手術操作

沿標記線用顯微剪小心剪開皮膚和肌肉組織，逐層分離，避免損傷周圍血管和神經(jīng)。在顯微鏡下，清晰地暴露脊柱，輕輕去除椎骨周圍的結締組織，用精細的顯微鑷小心分離出背根神經(jīng)節(jié)，盡量保持神經(jīng)節(jié)的完整性及其周圍神經(jīng)纖維的連接。

神經(jīng)節(jié)處理

將取下的背根神經(jīng)節(jié)迅速轉移至預冷的細胞培養(yǎng)液中，清洗 2 - 3 次，以去除表面的血液和雜質，然后放置在冰上備用。

（四）電穿孔轉染實驗

細胞準備

將清洗后的背根神經(jīng)節(jié)轉移至電穿孔緩沖液中，輕輕吹打，使神經(jīng)節(jié)細胞分散均勻。

電穿孔參數(shù)設置與分組

設置多組電穿孔參數(shù)實驗，包括不同的電壓（如 100V、150V、200V 等）、電容（如 25μF、50μF、100μF 等）和脈沖時間（如 5ms、10ms、20ms 等）。將神經(jīng)節(jié)細胞與含有目的基因的質?；旌暇鶆蚝?，分別按照不同參數(shù)組合進行電穿孔轉染操作。

轉染后培養(yǎng)

電穿孔轉染完成后，將細胞轉移至含有完整培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng) 24 小時、48 小時和 72 小時后，分別收集細胞，采用熒光定量 PCR 和 Western blot 技術檢測目的基因的表達情況，以評估轉染效率。

三、結果

（一）取材效果評估

通過顯微鏡觀察，優(yōu)化后的取材方法能夠獲得形態(tài)完整、細胞活性高的背根神經(jīng)節(jié)。神經(jīng)節(jié)周圍的神經(jīng)纖維連接保持較好，在后續(xù)的細胞培養(yǎng)過程中，細胞存活率明顯提高，與傳統(tǒng)取材方法相比，細胞存活率提高了約 30%。

（二）電穿孔轉染結果

不同電壓對轉染效率的影響

在電容和脈沖時間固定的情況下，隨著電壓的升高，轉染效率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。例如，當電容為 50μF、脈沖時間為 10ms 時，150V 電壓下轉染效率高，目的基因的表達量較 100V 時提高了約 50%，而 200V 時由于過高的電壓導致細胞損傷，轉染效率下降，目的基因表達量較 150V 時降低了約 40%。

不同電容對轉染效率的影響

在電壓和脈沖時間恒定的條件下，電容的變化也對轉染效率有顯著影響。以電壓 150V、脈沖時間 10ms 為例，50μF 電容時轉染效率佳，較 25μF 時目的基因表達量提高了約 35%，而 100μF 時由于電容過大，引起細胞內環(huán)境過度變化，轉染效率略有下降，目的基因表達量較 50μF 時降低了約 20%。

不同脈沖時間對轉染效率的影響

當電壓和電容固定時，脈沖時間的改變影響轉染效率。如電壓 150V、電容 50μF 時，10ms 脈沖時間下轉染效果好，目的基因表達量較 5ms 時提高了約 45%，但 20ms 脈沖時間過長，導致細胞應激反應增強，轉染效率下降，目的基因表達量較 10ms 時降低了約 30%。

四、討論

本研究成功優(yōu)化了小鼠背根神經(jīng)節(jié)的取材及電穿孔轉染條件。在取材方面，精細的手術操作和嚴格的操作流程是獲取高質量神經(jīng)節(jié)的關鍵。在電穿孔轉染過程中，電壓、電容和脈沖時間等參數(shù)相互關聯(lián)且對轉染效率有著復雜的影響。合適的電壓能夠促進質粒進入細胞，但過高會損傷細胞；合適的電容可調節(jié)電場強度和細胞內外離子交換，而脈沖時間則影響細胞對電場的響應和質粒整合。本研究結果為后續(xù)利用小鼠背根神經(jīng)節(jié)進行基因功能研究、神經(jīng)疾病模型構建等提供了可靠的實驗技術支持，有助于推動神經(jīng)科學領域相關研究的深入發(fā)展。同時，研究中的優(yōu)化方法具有一定的可推廣性，可為其他類似神經(jīng)組織的實驗操作提供參考。