一、引言

二、納米線電極細(xì)胞電轉(zhuǎn)染裝置的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

1. 納米線電極的制備

• 首先，選擇合適的基底材料，如硅片或玻璃片，對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的清洗和預(yù)處理，以確保表面的平整度和潔凈度。采用化學(xué)氣相沉積（CVD）技術(shù)或電化學(xué)沉積技術(shù)在基底上生長(zhǎng)納米線。以制備硅納米線為例，在化學(xué)氣相沉積過程中，利用硅源氣體（如硅烷）在高溫和催化劑的作用下分解并在基底表面沉積形成硅納米線。通過精確控制反應(yīng)溫度、氣體流量、反應(yīng)時(shí)間等參數(shù)，可以調(diào)控納米線的直徑、長(zhǎng)度和密度。

• 對(duì)生長(zhǎng)好的納米線進(jìn)行后處理，包括清洗去除雜質(zhì)、表面修飾等步驟。表面修飾可以采用生物相容性良好的材料，如聚乙二醇（PEG）等，以減少納米線對(duì)細(xì)胞的毒性并提高其與細(xì)胞的相互作用。

2. 電轉(zhuǎn)染裝置的構(gòu)建

• 將制備好的納米線電極集成到一個(gè)特制的電轉(zhuǎn)染腔室中。腔室的設(shè)計(jì)要考慮細(xì)胞懸液的容納量、電極間距的可調(diào)節(jié)性以及與外部電源的連接方式。采用微加工技術(shù)制作腔室的外殼，確保其密封性和生物相容性。

• 在腔室內(nèi)設(shè)置進(jìn)樣口和出樣口，以便于細(xì)胞懸液的注入和取出。同時(shí)，安裝溫度控制系統(tǒng)和監(jiān)測(cè)裝置，保證轉(zhuǎn)染過程在適宜的溫度條件下進(jìn)行，并且能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)腔室內(nèi)的物理參數(shù)（如電場(chǎng)強(qiáng)度、電流等）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)與準(zhǔn)備

• 選用常見的細(xì)胞系，如 HeLa 細(xì)胞或 293T 細(xì)胞，在適宜的培養(yǎng)基（如 DMEM 培養(yǎng)基，添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素）中進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞置于 37°C、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

• 轉(zhuǎn)染前，收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞兩次，然后將細(xì)胞重懸于電轉(zhuǎn)染緩沖液（如 Opti - MEM 培養(yǎng)基，添加適量的葡萄糖和電解質(zhì)）中，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適范圍（如 1×10? - 5×10? cells/mL）。

2. 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)操作

• 將含有外源核酸（如綠色熒光蛋白基因表達(dá)質(zhì)粒）的溶液與細(xì)胞懸液按照一定比例混合均勻。將混合后的細(xì)胞懸液緩慢注入到納米線電極電轉(zhuǎn)染裝置的腔室內(nèi)，確保細(xì)胞均勻分布在納米線電極周圍。

• 連接外部電源，設(shè)置不同的電壓參數(shù)（如 5 - 20 V）、脈沖寬度（如 10 - 50 ms）和脈沖次數(shù)（如 1 - 5 次）等。在電轉(zhuǎn)染過程中，利用監(jiān)測(cè)裝置記錄電場(chǎng)強(qiáng)度、電流變化等數(shù)據(jù)。

• 電轉(zhuǎn)染完成后，將細(xì)胞懸液在腔室內(nèi)靜置 5 - 10 分鐘，然后緩慢取出，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，加入新鮮的完整培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

3. 檢測(cè)與分析

• 在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)（如 24、48、72 小時(shí)），利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，以評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。通過計(jì)算表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例來確定轉(zhuǎn)染效率。

• 采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（如臺(tái)盼藍(lán)拒染法）檢測(cè)細(xì)胞的存活率。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞與臺(tái)盼藍(lán)溶液混合，在顯微鏡下觀察未被染成藍(lán)色的活細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞存活率。同時(shí)，利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行分析，進(jìn)一步了解電轉(zhuǎn)染過程對(duì)細(xì)胞的影響。

四、結(jié)果與討論

1. 轉(zhuǎn)染效率的影響因素

• 電壓參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率有著顯著的影響。隨著電壓的升高，轉(zhuǎn)染效率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在較低電壓下，電場(chǎng)強(qiáng)度不足，難以促使外源核酸有效地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；而當(dāng)電壓過高時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或功能喪失，從而降低轉(zhuǎn)染效率。例如，在 10 - 15 V 的電壓范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較高，可達(dá)到 30% - 50%。

• 脈沖寬度和脈沖次數(shù)也與轉(zhuǎn)染效率密切相關(guān)。適當(dāng)增加脈沖寬度和脈沖次數(shù)能夠提高轉(zhuǎn)染效率，但同樣需要注意避免過度的電刺激對(duì)細(xì)胞造成損傷。當(dāng)脈沖寬度為 20 - 30 ms、脈沖次數(shù)為 2 - 3 次時(shí)，在一定電壓條件下可獲得較好的轉(zhuǎn)染效果。

2. 細(xì)胞存活率的變化

• 與傳統(tǒng)電穿孔法相比，納米線電極細(xì)胞電轉(zhuǎn)染裝置在相同轉(zhuǎn)染效率的情況下，能夠顯著提高細(xì)胞的存活率。這是由于納米線電極能夠在較低的電壓下產(chǎn)生局部增強(qiáng)的電場(chǎng)，減少了對(duì)整個(gè)細(xì)胞群體的電場(chǎng)沖擊。例如，傳統(tǒng)電穿孔法在轉(zhuǎn)染效率達(dá)到 30% 左右時(shí)，細(xì)胞存活率可能僅為 50% - 60%，而本研究中的納米線電極裝置在轉(zhuǎn)染效率為 30% - 50% 時(shí)，細(xì)胞存活率可維持在 70% - 80%。

• 細(xì)胞存活率還與納米線的表面修飾材料有關(guān)。采用生物相容性良好的聚乙二醇修飾的納米線電極能夠進(jìn)一步提高細(xì)胞的存活率，減少細(xì)胞與納米線之間的非特異性相互作用和潛在的毒性反應(yīng)。

3. 裝置的應(yīng)用前景

• 本納米線電極細(xì)胞電轉(zhuǎn)染裝置在基因治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。例如，在癌癥基因治療中，可以將治療性基因（如抑癌基因）高效地導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的基因調(diào)控，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

• 在細(xì)胞工程方面，能夠用于細(xì)胞的基因編輯和改造，如誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS 細(xì)胞）的制備。通過精確控制轉(zhuǎn)染過程，可以將特定的轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)塍w細(xì)胞內(nèi)，使其重編程為 iPS 細(xì)胞，為再生醫(yī)學(xué)和疾病模型的建立提供有力的工具。

五、結(jié)論