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誠信經(jīng)營質(zhì)量保障價格合理服務(wù)完善本研究旨在探討外源性端粒酶基因(hTERT)轉(zhuǎn)染對豬氣管上皮細胞(STECs)增殖特性的影響。通過脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒pCI-neo-hTERT導(dǎo)入STECs,轉(zhuǎn)染后的細胞表現(xiàn)出增高的增殖活性,并保持基本的細胞生物學(xué)特征,為建立穩(wěn)定傳代的細胞系提供了可能。
哺乳動物的氣管黏膜上皮細胞(Trachea epithelium cells, TECs)不僅是多種病原體的靶細胞,也是阻擋病原入侵的重要屏障。豬氣管上皮細胞(Swine trachea epithelium cells, STECs)作為研究豬呼吸道疾病發(fā)病機制的重要模型,其體外培養(yǎng)技術(shù)的建立具有重要意義。然而,原代培養(yǎng)的STECs存在壽命短暫的局限性,限制了其廣泛應(yīng)用。端粒酶是一種能夠維持端粒長度的核糖核蛋白復(fù)合物,通過激活端粒酶,可以延長細胞在體外培養(yǎng)的壽命,從而實現(xiàn)細胞的永生化。本研究通過轉(zhuǎn)染外源性端粒酶基因(hTERT)至STECs,探討其對細胞增殖特性的影響,旨在為建立永生化的豬氣管上皮細胞系奠定基礎(chǔ)。
細胞:初生仔豬氣管黏膜上皮細胞(STECs)
質(zhì)粒:重組質(zhì)粒pCI-neo-hTERT
試劑:某品牌鏈酶蛋白酶、某品牌脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、某品牌G418抗生素、某品牌RNA提取試劑、某品牌PCR擴增試劑、某品牌Western blot試劑
儀器:倒置顯微鏡、某品牌PCR儀、某品牌電泳儀、某品牌Western blot成像系統(tǒng)、威尼德電穿孔儀
STECs的分離與培養(yǎng):無菌采取初生仔豬氣管,采用鏈酶蛋白酶灌注冷消化法分離得到原代STECs。分離后的細胞在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng),并觀察細胞形態(tài)。
細胞鑒定:采用間接免疫熒光法鑒定8型角蛋白的上皮源性,確認分離得到的細胞為豬氣管上皮細胞。
基因轉(zhuǎn)染:以脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒pCI-neo-hTERT導(dǎo)入STECs。脂質(zhì)體與質(zhì)粒的體積比為1:3,轉(zhuǎn)染48小時后加G418進行抗性篩選1個月,得到抗G418的陽性克隆,繼續(xù)擴大培養(yǎng)。
基因表達檢測:采用PCR和Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后STECs中hTERT基因的表達情況。
細胞增殖活性檢測:用MTT法和流式細胞儀分別檢測轉(zhuǎn)染細胞的活力和增殖周期。
通過倒置顯微鏡觀察,轉(zhuǎn)染后的STECs形態(tài)正常,細胞呈單層貼壁,多邊形鋪路石狀生長。PCR擴增得到大小為461 bp的hTERT基因片段,Western blot檢測得到大小為125 ku的特異性條帶,表明hTERT基因在轉(zhuǎn)染細胞中成功表達。
細胞活力曲線顯示,轉(zhuǎn)染后的STECs在接種后的第3~5天增殖速度最快。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染細胞的細胞核型為2倍體,S期細胞比例達到48.35%,說明轉(zhuǎn)染后的細胞具有較高的增殖活性。
經(jīng)過長期培養(yǎng),轉(zhuǎn)染hTERT基因的STECs成功建立了永生化的細胞系,可傳代至55代以上,且保持了原代細胞的形態(tài)及功能特性。永生化細胞系具有正常的細胞增殖周期,比原代細胞生長更為活躍。
端粒是影響細胞永生化機制的重要因素之一。端粒長度決定了細胞的增殖能力和壽命,足夠長的端粒長度能在染色體末端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),提供保護。當(dāng)端粒縮短到一定程度時,細胞將逐漸失去增殖能力,導(dǎo)致衰老和死亡。通過激活端粒酶,可以延長染色體末端DNA,確保端粒足夠的長度,從而延長細胞在體外培養(yǎng)的壽命。本研究通過轉(zhuǎn)染hTERT基因,成功激活了STECs的端粒酶活性,實現(xiàn)了細胞的永生化。
永生化細胞系具有長期培養(yǎng)、增殖活性高、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點,是研究疾病發(fā)病機制、藥物篩選和疫苗開發(fā)的重要工具。本研究建立的永生化的STECs不僅保持了原代細胞的形態(tài)及功能特性,還具有更高的端粒酶活性和增殖活性。該細胞系可用于豬呼吸道病原體的感染研究,為揭示豬呼吸道疾病的發(fā)病機制提供新的細胞模型。
本研究采用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒pCI-neo-hTERT導(dǎo)入STECs,通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,提高了轉(zhuǎn)染效率。同時,通過嚴格的抗性篩選和純化步驟,成功建立了永生化的細胞系。該細胞系的建立不僅為豬呼吸道疾病的研究提供了新的細胞模型,也為其他動物細胞永生化的研究提供了借鑒。
方法創(chuàng)新:本研究采用脂質(zhì)體法將hTERT基因轉(zhuǎn)染至STECs,成功實現(xiàn)了細胞的永生化,為豬呼吸道上皮細胞的長期培養(yǎng)提供了新方法。
模型創(chuàng)新:建立的永生化的STECs保持了原代細胞的形態(tài)及功能特性,具有更高的增殖活性,為豬呼吸道病原體的感染研究提供了新的細胞模型。
疾病研究:永生化的STECs可用于豬呼吸道病原體的感染研究,揭示病原體的致病機制和宿主的防御機制。
藥物篩選:該細胞系可用于藥物篩選,評估藥物對豬呼吸道病原體的抑制作用和細胞毒性。
疫苗開發(fā):永生化的STECs可作為疫苗開發(fā)的細胞基質(zhì),用于生產(chǎn)高效、安全的疫苗。