摘要：

本研究采用豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)出原代豬成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行了不同時(shí)期的綠色熒光蛋白(GFP)陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，原代細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)染效率，且傳代和復(fù)蘇細(xì)胞亦能成功轉(zhuǎn)染。該研究為豬成纖維細(xì)胞的基因編輯和體細(xì)胞克隆提供了有價(jià)值的參考。

引言：

成纖維細(xì)胞作為重要的供體細(xì)胞之一，在醫(yī)學(xué)、動物科學(xué)及基礎(chǔ)研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。在醫(yī)學(xué)上，成纖維細(xì)胞可用于疾病診斷、人工皮膚制備、組織創(chuàng)傷修復(fù)及組織器官培養(yǎng)等方面。在動物科學(xué)領(lǐng)域，成纖維細(xì)胞則可用于體細(xì)胞克隆及轉(zhuǎn)基因研究，以實(shí)現(xiàn)瀕危畜禽的保種及擴(kuò)繁、優(yōu)良品種的快速繁育及轉(zhuǎn)基因新品種的培育。此外，在基礎(chǔ)研究中，成纖維細(xì)胞為遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)、胚胎學(xué)、組織學(xué)及免疫學(xué)等提供了基礎(chǔ)材料和分離培養(yǎng)模式。

鑒于成纖維細(xì)胞的重要性，建立一種快速、實(shí)用、簡便的豬成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)方法顯得尤為重要。豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法作為一種有效的分離培養(yǎng)方法，具有操作簡便、細(xì)胞分裂增殖能力強(qiáng)、適應(yīng)性好及性狀穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。然而，關(guān)于該方法分離出的成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率研究尚不充分。因此，本研究旨在通過豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)出原代豬成纖維細(xì)胞，并探究其不同時(shí)期的GFP陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，為豬成纖維細(xì)胞的基因編輯和體細(xì)胞克隆提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

材料與方法：

1. 材料

實(shí)驗(yàn)動物選用新生小豬，超凈工作臺、威尼德電穿孔儀、超低溫冰箱、CO2培養(yǎng)箱、眼科剪、培養(yǎng)瓶、離心管、血球計(jì)數(shù)板等儀器，以及乙醇、PBS溶液、某品牌DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、中性蛋白酶、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、臺盼藍(lán)、EDTA、DMSO等試劑。

2. 方法

2.1 豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞

新生小豬出生后立即取其尾尖組織，以75%酒精擦拭消毒后，用手術(shù)剪刀剪下約2cm長的豬尾組織，投入75%酒精中浸泡60秒后，以無菌PBS沖洗3次，轉(zhuǎn)移至含有15%FBS的某品牌DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于冰盒后帶回實(shí)驗(yàn)室。在安全柜內(nèi)，用PBS（含雙抗）洗滌豬尾組織數(shù)次后，剪下長約1.5cm的組織塊，轉(zhuǎn)移至另一無菌直徑為10cm的玻璃培養(yǎng)皿中，加入幾滴血清后以彎頭手術(shù)剪刀剪碎至1mm3小塊。加入20mL消化緩沖液，放入39℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化。消化后的組織塊貼壁培養(yǎng)于含有10%FBS的某品牌DMEM培養(yǎng)基中，定期觀察并更換培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長至80%-90%匯合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行凍存。將細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，離心收集細(xì)胞沉淀，加入含有10%DMSO和90%FBS的凍存液，混勻后分裝至凍存管中，置于-80℃冰箱過夜后，轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。復(fù)蘇時(shí)，將凍存管從液氮罐中取出，迅速置于37℃水浴中解凍，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入含有10%FBS的某品牌DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后更換新鮮培養(yǎng)基。

2.3 GFP陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

采用威尼德電穿孔儀進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10^6個/mL。取100μL細(xì)胞懸液與適量GFP陽性質(zhì)?；靹蚝?，加入電穿孔杯中。設(shè)置電穿孔參數(shù)為電壓1200V/cm，脈沖時(shí)間3ms。電轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有10%FBS的某品牌DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。分別在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)和48小時(shí)，采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的GFP質(zhì)粒陽性表達(dá)率。

結(jié)果：

1. 豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞

采用豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)出原代豬成纖維細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)呈多邊形，生長均勻，貼壁良好。原代細(xì)胞活力很高，細(xì)胞存活率達(dá)到97.670%。經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞存活率仍為95.670%。復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率亦在90%以上，且能保持原代細(xì)胞的生物學(xué)特性。原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)和復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線均呈“S"型，但復(fù)蘇細(xì)胞的生長速度略微緩慢。

2. GFP陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率

原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)和復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞在電轉(zhuǎn)染后均能成功表達(dá)GFP質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，熒光顯微鏡即可檢測到GFP質(zhì)粒陽性表達(dá)的成纖維細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測顯示原代細(xì)胞陽性率為8.01%，稍高于傳代細(xì)胞的7.91%和復(fù)蘇細(xì)胞的7.86%。復(fù)蘇細(xì)胞存活率有所下降，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活力亦有所降低，但轉(zhuǎn)染后仍可得到7.86%的GFP質(zhì)粒陽性表達(dá)率。

討論：

1. 豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法的優(yōu)勢

本研究采用豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)出原代豬成纖維細(xì)胞。該方法操作簡便，對細(xì)胞損傷小，且細(xì)胞分裂增殖能力強(qiáng)，適應(yīng)性好，性狀穩(wěn)定。此外，該方法還能模擬體內(nèi)生長狀況，簡化生長環(huán)境，明確生長條件，便于施加實(shí)驗(yàn)因素及獲得直接活體觀察結(jié)果。因此，豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法在豬成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)中具有廣泛應(yīng)用前景。

2. 轉(zhuǎn)染效率的影響因素

原代細(xì)胞為混雜細(xì)胞，且比較脆弱、不穩(wěn)定，因此其轉(zhuǎn)染條件無法沿用純化建系的細(xì)胞。本研究在電轉(zhuǎn)染過程中，對電壓和脈沖時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，在電壓1200V/cm、脈沖時(shí)間3ms的條件下，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高。此外，GFP陽性質(zhì)粒的濃度對原代細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染率影響較小，當(dāng)其濃度達(dá)到一定值后，轉(zhuǎn)染率間無顯著差異。這一結(jié)果與傳代細(xì)胞系相似。

3. 研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景

本研究的創(chuàng)新之處在于采用豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)出原代豬成纖維細(xì)胞，并探究了其不同時(shí)期的GFP陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。研究結(jié)果為豬成纖維細(xì)胞的基因編輯和體細(xì)胞克隆提供了有價(jià)值的參考。在應(yīng)用前景方面，該方法可用于轉(zhuǎn)基因豬的制備、疾病模型的建立以及瀕危畜禽的保種及擴(kuò)繁等領(lǐng)域。此外，該方法還可為其他物種成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染效率研究提供借鑒和參考。